Methoden

Welche Kombination am sinnvollsten ist, richtet sich nach der Probe und der Fragestellung.
(Diese Aufstellung erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit, sondern orientiert sich daran, welche Methoden in dieser Abteilung aktuell eingesetzt werden - es gibt mehr als hier gezeigt werden kann!)

Probeneinlass

Die Probe wird in einem Gaschromatographen in ihre Komponenten getrennt. Die Trennsäule endet direkt in der Ionenquelle. Geeignet für alle Gemische, die GC-gängig sind.

Ionisierung: EI oder CI

Die Probe wird durch die LC-Säule getrennt und nach dem Durchlauf durch einen DAD-Detektor zum Massenspektrometer geleitet.

Ionisierung: ESI, APCI

1-10µl der gelösten Probe wird in eine Probenschleife gegeben. Die Probe wird mit einem Flüssigkeitsstrom (normal: 95% MeOH/5% H2O, 0.02 mL/min) dann zum ESI-Massenspektrometer gefördert. Es erfolgt keine Trennung.

Ionisierung: ESI, APCI

Die Probe wird in einen sehr kleinen Aluminiumtiegel gegeben und mit einer Schubstange in das Hochvakuum des Massenspektrometers eingeschleust. Die Schubstange kann bis zu 350°C hochgeheizt werden, so dass die Probe verdampft wird.
Bei diesem Vorgang kann man auch unterschiedlich flüchtige Komponenten voneinander trennen.

Ionisierung: EI oder CI

Die gelöste Probe wird auf eine Spritze aufgezogen. Über eine Spritzenpumpe wird ein konstanter Volumenstrom in die Ionenquelle gepumpt und die Lösung wird dort versprüht. Es erfolgt keine Trennung, kann aber bei LM- und luftempfindlichen Proben eingesetzt werden.

Ionisierung: ESI, APCI

Ionenquelle

Die Moleküle werden im Hochvakuum durch Beschuss mit Elektronen (70 eV) ionisiert. Es entstehen überwiegend Radikalkationen. Zusätzlich zu den für die Ionisation notwendigen 6-11eV werden 2-10eV Überschussenergie übertragen. Das führt zu einer mehr oder weniger starken Fragmentierung, die sehr spezifisch für die entsprechende Verbindung ist. Datenbanksuchen sind daher gut möglich.
Alle Moleküle (soweit unzersetzt verdampfbar) können so ionisiert werden.

EI

Bei der Chemischen Ionisation wird in die Ionenquelle zu den thermisch verdampften Probenmolekülen ein Überschuss an Reaktandgas eingelassen, das durch Elektronenbeschuss ionisiert wird. Die durch den Elektronenbeschuss gebildeten Primärionen des Reaktandgases reagieren durch eine Serie von Stößen mit weiteren Reaktandgasmolekülen zu den eigentlich ionisierend wirkenden stabilen Ionen (CI-Plasmaionen). Diese Reaktandgasionen ionisieren Analyt-Moleküle in der Gasphase durch Protonierung in Ionen-Molekül-Reaktionen. In der Regel sind CI-Spektren deutlich fragmentärmer als entsprechende EI-Spektren und zeigen höhere relative Molekülionenintensitäten.

CI

ESI ist eine weiche Ionisierungsmethode, bei der Ionen aus der Lösung in die Gasphase überführt werden. Als flüchtige polare Lösungsmittel werden Wasser, Methanol, Acetonitril ggfs. unter Zusatz von apolaren Lösungsmitteln (CHCl3, CH2Cl2…) bevorzugt. Die Ionenbildung kann man durch Zugabe von Salzen oder durch pH-Wertänderungen unterstützen.

Die Lösungen der Substanzen werden mit Unterstützung eines Sprühgases durch eine Kapillare bei Atmosphärendruck in die Ionenquelle eingebracht. Die elektrisch leitende Sprühkapillare wird in Bezug auf eine Gegenelektrode auf einem hohen elektrischen Potenzial gehalten. Durch das entstehende elektrische Feld, kommt es in der austretenden Flüssigkeit zur Ladungstrennung und zur Deformation des Meniskus zum Konus (Taylor-Konus).

An der Spitze des Konus bildet sich ein feiner Flüssigkeitsstrahl, der in viele kleine Tröpfchen zerfällt. Die Tröpfchen enthalten je nach Richtung des elektrischen Feldes Kationen oder Anionen. Somit bildet sich ein feiner Spray.

Die elektrisch geladenen Teilchen werden zur Transferkapillare getrieben. Auf dem Weg verdampft das Lösungsmittel, wodurch die Größe der Tröpfchen abnimmt und die Ladungsdichte zunimmt. Um die Lösungsmittelverdampfung zu unterstützen wird ein heißer Stickstoffgegenstrom eingeblasen. Dabei zerfallen die Tröpfchen in Mikrotröpfchen (Coulomb-Explosion).

ESI eignet sich für Substanzen hoher Polarität und für ionische Analyte. Es bilden sich, abhängig von der Chemie der Probe, auch mehrfach geladene Teilchen oder Zusammenlagerungen von Molekülen. Als Faustregel gilt, dass Pro 1000 Da ca. 1 Ladung übetragen wird. Somit können auch sehr große Moleküle gemessen werden.

Es ist ein schonendes Verfahren, das heißt man sieht meist das (Quasi-)Molekülion. Bei der Ionisierung lagern sich gerne Adduktionen an ([M+NH4]+, [M+Na]+, [M+Cl]-, [M+HCOO]- …)

 

ESI

Bei der APCI findet die chemische Ionisation (Kationisierung bzw. Anionisierung) im Gegensatz zum Electrospray in der Gasphase statt. Hierbei wird die Ladung mittels eines Reaktands, in der Regel die mobile Phase, übertragen. Eine Lösung des Analyten wird durch eine Kapillare in einem Stickstoffstrom zerstäubt, wobei ein Spray entsteht. Das Spray wird durch eine beheizte Keramik (300-400 °C) geführt, wo das Lösungsmittel vollständig verdampft wird. Der austretende Dampf wird durch Anlegen einer Hochspannung (ca. 5 kV) über eine nadelartige Elektrode (sog. Coronanadel) in ein Plasma überführt. In dem Plasma werden zunächst aus dem Lösungsmittel Ionen gebildet. Die ionisierten Lösungsmittelmoleküle wiederum ionisieren die Analytmoleküle, die dann ins Vakuum überführt werden.

APCI eignet sich für Moleküle mit nur wenigen Heteroatomen, die mit ESI nicht effizient ionisiert werden können. Es müssen aber wie bei ESI protonierbare oder deprotonierbare Heteroatome vorhanden sein! Ein großer Unterschied zur ESI besteht darin, dass bei der APCI nur einfach geladene Analyt-Ionen entstehen und man meist nur [M+H]+ detektiert.

APCI

LIFDI ist eine Variante der Felddesorption (FD). Bei der Felddesorption werden Moleküle in einem elektrischen Feld mit einer hohen Feldstärke ionisiert. Diese lassen sich erreichen, indem die Anode aus einem Metalldraht mit zahlreichen Spitzen (Mikronadeln aus Graphitdentriten) versehen ist. An den Spitzen dieser feinen Verästelungen bilden sich beim Anlegen einer Hochspannung sehr hohe Feldstärken aus, die letztlich zum Abziehen einzelner Elektronen aus den Analytmolekülen und so zu deren schonender Kationisierung führen. Alternativ können auch protonierte oder bereits geladene Analyte freigesetzt werden. In der Regel tritt selbst bei labilen Molekülen oder solchen mit vielen Heteroatomen keinerlei Fragmentierung auf.

LIFDI1

Bei der LIFDI wird der Emitter direkt im Hochvakuum der Ionenquelle beladen. Dazu wird die Probenlösung (0.1–0.2 mg/mL) durch eine dünne Kapillare vom Vakuum der Ionenquelle angesaugt, sobald man das freie Ende der Kapillare in die Lösung eintaucht. Ein Tropfen fließt dann auf den Emitter, wo das Lösemittel im Vakuum sehr schnell verdampft.

Zwischen der Anode (dem Emitter) und der Kathode als Gegenelektrode liegt eine Spannung von einigen tausend Volt an. Sobald die Hochspannung anliegt, krümmt sich der Emitter Richtung Gegenelektrode und der Kontakt zwischen Kapillare und Anode wird unterbrochen. Die Ionisierung geschieht schonend in einem hohen elektrischen Feld sowohl im Raum zwischen den Elektroden als auch an der Oberfläche der Anode. Die Beladung kann mehrfach wiederholt werden, da der Emitter von hinten beladen wird. Dies verbessert u.a. die Empfindlichkeit. Man kann die Analytlösung zudem unter inerten Bedingungen halten und damit reaktive, luft- und feuchtigkeitsempfindliche (metallorganische) Proben analysieren

LIFDI1

Bei unpolaren Analyten sieht man meist ein M+∙- bzw. M2+- Signal, bei polaren Analyten meist [M+H]+ bzw. [M+Alkali]+.

 

Massenanalysator

Im Sektorfeld-Analysator werden die Ionen in elektrischen und magnetischen Feldern aufgrund ihrer Energie bzw. ihres Impulses abgelenkt. Die Masse kann dann in Kenntnis von Ladung, Energie und Impuls ermittelt werden. Vorteile von Sektorfeld-Instrumenten sind in einer sehr genauen Massenbestimmung und einem hohen dynamischen Bereich zu sehen (bei gutem Auflösungsvermögen).

sektorfeld

(Umgekehrte Nier-Johnson Geometrie wie beim Finnigan MAT 95)

Die Ionenfalle besteht aus einem Ringelektrodensystem, in dem die Ionen mit einem bestimmten m/z-Verhältnis zurückgehalten werden können und dann in einem zweiten Schritt nachgewiesen werden. Dadurch wird eine sehr hohe Selektivität erreicht. Zudem sind die Ansprüche an das benötigte Vakuum nicht so hoch, jedoch können lediglich eine begrenzte Auswahl an Zielmolekülen, wenn auch mit hoher Nachweis-empfindlichkeit, detektiert werden. Innerhalb einer solchen Falle sind (zeitlich hintereinander) mehrstufige MS-MS Experimente möglich. Meist kann aber nur die Nominalmasse bestimmt werden.

ionenfalle

Das für die Massentrennung verwendete elektrische Feld wird hierbei von 4 Metallstäben erzeugt, das jeweils ein Ion mit bestimmten m/z-Verhältnis zum Detektor durchlässt, während die übrigen Ionen an den Stäben hängen bleiben. Durch Variation der angelegten Spannung kann der Massenbereich durchgescannt werden. 
Der Vorteil dieser kompakten Messinstrumente ist der kostengünstige und reproduzierbare Einsatz. Solche Analysatoren können hintereinandergeschaltet werden. Eine (bei Bedarf) gasgefüllte Kammer zwischen ihnen ermöglicht MS-MS Experimente (Triple Quad MS). 

Quadrupole besitzen ein nur moderates Auflösungsvermögen und die Effizienz ist begrenzt, da zu jedem Zeitpunkt nur ein geringer m/z-Bereich erfasst werden kann. 

quadrupol

Mit Time-Of-Flight-Analysatoren (TOF) wird die Flugzeit verschiedener Ionen bestimmt, wobei die erzeugten Ionen zunächst durch einen kurzen Spannungsstoß (orthogonal) beschleunigt werden. Die entsprechende Flugzeit hängt von der Geschwindigkeit nach der Beschleunigungsphase im elektrischen Feld ab und ist proportional zum Quotienten aus Masse zu Ladung (m/z; schwere Ionen sind langsamer als leichte Ionen). Wesentliche Vorteile von TOF-Instrumenten sind der prinzipiell unbegrenzte Massenbereich, ein mit der Masse ansteigendes Auflösungsvermögen, sehr gute Nachweisempfindlichkeiten und sehr kurze Aufnahmezeiten.

Die Auflösung des TOF´s kann durch ein gutes Vakuum und die Nutzung eines Reflektors (Ionenspiegel) verbessert werden. Da die Ionen vor der gezielten Beschleunigung bereits über eine gewisse kinetische Energie verfügen, müssen die Ionen zeitlich fokussiert werden. Die Ionen mit höherer Energie dringen tiefer in das Bremsfeld des Reflektors ein und halten sich daher länger darin auf als Ionen mit niedriger Energie.

TOF

Die Orbitrap ist eine Ionenfalle, in der die Ionen in einem elektrostatischen Feld festgehalten werden. Dieses sehr neue Analysatorprinzip bietet eine sehr hohe Massenauflösung, Empfindlichkeit und Massengenauigkeit.

Orbitrap1

Die Orbitrap besteht aus einer zentralen spindelförmigen Elektrode und einer fassförmigen zweiteiligen Elektrode. Für eine stabile Bahn der Ionen um die Zentralelektrode, muss die elektrostatische Anziehung durch die Zentrifugalkraft des Ions kompensiert werden. Dadurch ergeben sich oszillierende Bewegungen (orbits) um die Zentralelektrode und gleichzeitig entlang der Spindelachse, die nur vom m/z-Verhältnis der entsprechenden Ionen abhängig ist. Diese axiale Oszillation ist unabhängig von der Anfangsgeschwindigkeit der Ionen.

orbitrapgleichung

Die Frequenz der axialen Schwingung verhält sich umgekehrt proportional zur Quadratwurzel des m/z-Verhältnisses der Ionen. Die Konstante k ist die Feldkrümmung. (Deshalb hat die Orbitrap ein sehr gutes Auflösungsvermögen bei höheren Massen.)

Gemessen wird der Bildstrom („image current“) auf der äußeren, in zwei Teilen gegliederten Elektrode. (Die Strom-Zeit-Kurve ist charakteristisch für ein bestimmtes m/z-Verhältnis.)

Dazu nutzt man den Effekt der Spiegelladung. Bewegen sich Ionen innerhalb der Orbitrap hin und her, verursachen sie durch ihr elektrisches Feld eine Ladungsverschiebung auf den Elektroden. Da die zwei Hälften der äußeren Elektrode durch einen isolierenden Ring voneinander getrennt sind, kann diese Influenz als Spannung proportional zur Schwingungsfrequenz ωz der Ionen abgegriffen werden. Das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis ergibt sich dann durch schnelle Fourier-Transformation (FFT) des Signals.

Orbitrap2

Da nur ein schmaler Bereich von Eintrittsbahnen stabile Bahnen der Ionen liefert, wird der Orbitrap eine C-Trap (gekrümmter Quadrupol) vorgeschaltet. In der C-Trap werden die Ionen in kleine Pakete konzentriert und gespeichert. Dadurch wird die Orbitrap von allen vorangehenden Schritten der Ionenerzeugung entkoppelt

Detektor

Die Ionen treffen auf eine Konversionsdynode (zylindrisch geformte Bleche). Hier werden durch den Impuls Elektronen gelockert, die von der nächsten Elektrode angezogen werden. Dort setzen sie weitere Elektronen frei. Dieser Vorgang wiederholt sich kaskadenartig zwischen den hintereinandergeschalteten Elektroden. Am Ende steht ein um 106 hoch verstärktes Signal zur Verfügung. Vorteile sind die hohe Nachweisempfindlichkeit, der große dynamische Bereich und kurze Ansprechzeiten für eine schnelle Registrierung.

SEV

Die FT ist eine mathematische Operation, mit der man zeitabhängige Rohsignale (Zeitdomäne) in frequenzabhängige Signale (Frequenzdomäne) umwandelt. Diese frequenzabhängigen Signale können, dann mit einem m/z-Verhältnis korreliert werden.

Da Frequenzen derzeit mit höherer Genauigkeit bestimmt werden können als jeder andere physikalische Parameter, bieten diese Systeme sehr hohe Auflösungen und Massengenauigkeiten. Je länger man den Beobachtungszeitraum wählt, desto genauer kann die Frequenz bestimmt werden. Diese Art der Detektion ist für die Ionen "zerstörungsfrei".

Die FT wird unter anderem bei Oribtraps und bei Ionen-Cyclotron-Resonanz-Massenspektrometern (FT-ICR-MS) als Detektor verwendet.

fourier

Vakuumsystem

Um ein Vakuum im Gerät zu erzeugen dienen meist Drehschieberpumpen als Vorpumpen. Um anschließend ein Hochvakuum zu erreichen werden Turbomolekularpumpen oder Öldiffusionspumpen verwendet.

Gute Massenspektrometer erreichen ein Vakuum von 10-5 bis 10-10 mbar.

Verbesserte Vakuumbedingungen verlängern die mittlere freie Weglänge der Ionen und senken damit das Risiko von Stößen beim Transit durch den Analysator.

Die Flugstrecke der Ionen bis zu einem Zusammenstoß mit anderen Teilchen beträgt bei Atmosphärendruck ca. 3.5 * 10-6 mbar, bei 10-5 mbar ca. 1 m und bei 10-6 mbar ca. 100 m.

Ein besseres Vakuum ist folglich meist essenziell für ein gutes Massenauflösungsvermögen und gute Massengenauigkeit.

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